Công nghệ ENZYME

Enzyme là những loại protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tính năng tăng vận tốc và hiệu suất của một phản ứng hóa sinh chuyên hóa, mà sau phản ứng vẫn còn nguyên không bị phân hủy và giữ được năng lực xúc tác. Enzyme được ứng dụng trong rất nhiều nghành nghề dịch vụ khác nhau nhờ có tính đặc hiệu cao và công dụng trong điều kiện kèm theo “ êm dịu ”, tổng thể những enzyme có nguồn gốc tự nhiên đều không độc, những chế phẩm enzyme được sản xuất từ những nguồn nguyên vật liệu dễ kiếm và rẻ tiền .

Hiện nay, hằng năm thị trường enzyme thế giới tiêu thụ hơn 1,5 tỷ USD và người ta dự đoán con số này sẽ gấp đôi vào năm 2008. Trong vòng 10 năm qua, lượng enzyme được sản xuất hằng năm tăng lên 12%. Xấp xỉ 75% enzyme công nghiệp được sử dụng để thủy phân và khử trùng hợp (depolymerisation) các hợp chất tự nhiên phức tạp, trong đó protease chiếm ưu thế trong công nghiệp tẩy rửa và sản xuất bơ sữa. Các ứng dụng enzyme trong thực phẩm được xem là lớn nhất. Các ứng dụng này bao gồm chuyển hóa tinh bột thành glucose và fructose, phomát, rượu vang, bia, chất thơm, nước ép trái cây và thức ăn động vật (Bảng 6.1).

Sản xuất enzyme được tăng trưởng mạnh từ những năm 1960 nhờ ứng dụng công nghệ lên men vi sinh vật và gần đây hơn là nhờ những thành tựu của công nghệ di truyền. Các khung hình vi sinh vật tái tổng hợp ( recombinant microorganisms ) lúc bấy giờ trở thành nguồn nguyên vật liệu lợi thế cho sản xuất enzyme với sự phong phú của những loại khác nhau. Hướng ứng dụng này chắc như đinh sẽ tăng trưởng mạnh trong tương lai nhờ sự tiện nghi của kỹ thuật di truyền và sự phong phú và đa dạng của những loại enzyme có sẵn ở vi sinh vật được tìm thấy trong những môi trường tự nhiên phong phú và khắc nghiệt. Nhiều enzyme vi sinh vật sau khi được phát hiện đã được tăng trưởng để thay thế sửa chữa những enzyme đang có từ nguồn gốc động vật hoang dã và thực vật .
Bảng 6.1. Giá trị enzyme so với công nghiệp công nghệ sinh học Enzyme công nghiệp
Giá trị thị trường
( triệu USD )
Các protein dược phẩm
100
Các chất tẩy ( protease và lipase )
70
Công nghiệp sản xuất bơ sữa ( hầu hết là rennin )
50
Nghiên cứu ( phong phú enzyme )
42
Chế biến tinh bột
31
Chẩn đoán ( phong phú enzyme )
16
Công nghiệp dệt
12
Công nghiệp nước uống
11
Bánh mì
4,5
Biến đổi sinh học ( biotransformation )
4,5
Những cái khác
5
Tổng số
400
1. Các enzyme từ nguồn động-thực vật
– Các enzyme được sử dụng tiên phong có nguồn gốc từ những nguyên vật liệu thực vật và động vật hoang dã. Mặc dù, sản xuất enzyme từ nguồn vi sinh vật có hiệu suất cao kinh tế tài chính cao hơn nhưng lúc bấy giờ vẫn còn nhiều quy trình sản xuất enzyme có hiệu suất cao nhờ vào những nguồn động-thực vật .
– Các cơ quan và mô của động vật hoang dã cung ứng những nguồn nguyên vật liệu lý tưởng cho một số ít enzyme như lipases, esterases và protease, trong đó đáng kể nhất là rennet1, pepsin2, trypsin3 và chymosin4. Trứng gà vẫn là nguồn nguyên vật liệu tốt để sản xuất lysozyme. Các cây xanh được dùng làm nguồn nguyên vật liệu lý tưởng cho proteases như : bromelain từ dứa ( thơm ), papain từ đu đủ và ficin từ quả sung ( Bảng 6.2 ) .
– Nói chung, những nguồn động vật hoang dã có khuynh hướng phân phối enzyme tốt hơn những nguồn thực vật ( Bảng 6.3 ). Mặc dù, những cây xanh nông nghiệp hoàn toàn có thể được trồng đặc biệt quan trọng cho sản xuất enzyme và một số ít đặc thù giống nhau của mẫu sản phẩm được bảo vệ tốt. Nhưng toàn bộ cây xanh đều phụ thuộc vào vào sự thuận tiện của những điều kiện kèm theo tự nhiên như thời tiết, thời vụ và khí hậu …
– Các nguyên vật liệu thô ( mô ) từ nguồn động vật hoang dã và thực vật được không thay đổi thường bằng cách ướp lạnh hoặc làm khô trước khi luân chuyển, được cho phép tích lũy một số lượng lớn đủ cho quy trình sản xuất enzyme theo từng mẻ .
Thông thường những nguyên vật liệu thích hợp không luôn luôn có sẵn và số lượng hoàn toàn có thể bị hạn chế. Những hạn chế này hoàn toàn có thể được cải tổ bằng sự tăng trưởng những enzyme vi sinh vật với những hoạt tính tương tự như và triển khai lên men vi sinh vật trên quy mô lớn .
1 Rennet : enzyme dịch vị, lấy ở dạ dày bò con dùng làm đặc sữa khi chế biến phomát .
2 Pepsin : enzyme của dịch vị động vật hoang dã có xương sống, xúc tác phản ứng phân giải những protein thành những amino acid hợp thành chúng .
3 Trypsin : enzyme xúc tác phản ứng thủy phân những link peptide trong protein và thủy phân từng phần protein, dẫn xuất từ trypsinogen dịch tụy tiết vào ruột non, được enzyme ruột non enterokinase ảnh hưởng tác động chuyển thành .
4 Chymosin ( rennin ) : enzyme đông sữa .

2. Các enzyme từ nguồn vi sinh vật
– Các vi sinh vật là nguồn enzyme thuận tiện nhất. Số lượng và sự phong phú của enzyme tỷ suất với số lượng và sự phong phú của những vi sinh vật. Các vi sinh vật được tích lũy từ những môi trường tự nhiên khắc nghiệt như suối nước nóng, vùng băng giá, rừng mưa nhiệt đới gió mùa và sa mạc .
– Mỗi loài sinh vật có những vi sinh vật đặc trưng phối hợp và do đó mức độ tiềm tàng của những hoạt tính enzyme là rất lớn. Các kỹ thuật của công nghệ di truyền cho phép công nghiệp enzyme tăng hiệu suất lên men của những enzyme này lên nhiều lần. Ngay cả đặc thù của những enzyme này cũng hoàn toàn có thể được biến hóa và cải tổ bởi công nghệ protein .
Bảng 6.2. Các enzyme từ nguồn thực vật Loài thực vật
Enzyme
Ứng dụng
Cây đậu nhiệt đới gió mùa của Mỹ ( Canavalia ensiformis )
Urease
Chẩn đoán
Đu đủ ( Carica papaya )
Papain
Nướng, sản xuất bơ sữa, thuộc da, mềm thịt
Sung ( Ficus carica )
Ficin
Mềm thịt
Dứa ( Ananas comosus )
Bromelain
Nướng ( khử phức tạp gluten )
Cây cải ngựa
( Armoracia rusticana )
Peroxidase
Chẩn đoán
Cây hạnh
( Amygdalus communis )
β-glucosidase
Nghiên cứu
Lúa mì ( Triticum aestivum )
Esterase
Tổng hợp và thủy phân ester
Lúa mạch
( Hordeum vulgare )
β-amylase
Nướng, nước sirô maltose
Đậu tương ( Glycine max )
β-amylase
Nướng, nước sirô maltose
Bảng 6.3. Các enzyme từ nguồn động vật hoang dã Loài động vật hoang dã
Enzyme
Bê, bò, dê con, cừu non, lợn
Diastase ( amylase ), pre-gastric esterase, lipase, pepsin, trypsin, phytase, chymosin ( rennin ), phospholipase
Trứng gà
Lysozyme
Nước tiểu người
Urokinase
Nhiều enzyme bị ức chế tự nhiên và chỉ hoàn toàn có thể được bộc lộ dưới những điều kiện kèm theo nuôi cấy nhất định. Các enzyme này hoàn toàn có thể là nội bào, đặc trưng ở trường hợp E. coli, và ngoại bào như ở những loài Bacillus. Các chủng thương mại của những loài Bacillus và Aspergillus không tái tổng hợp hoàn toàn có thể sản xuất enzyme tới nồng độ 20 kg / m3. Các nuôi cấy tái tổng hợp cũng hoàn toàn có thể sản xuất enzyme ở những hiệu suất tương tự như hoặc hơn .
3. Các enzyme đặc trưng loài
Một số những chủng Aspergillus hoàn toàn có thể sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau. Do những quy trình lên men tăng trưởng tốt, Asper. niger cũng được sử dụng thoáng rộng như một vật chủ cho sự bộc lộ của những enzyme tái tổng hợp. Loài này được biết hoàn toàn có thể sản xuất hơn 40 enzyme thương mại khác nhau, trong đó những enzyme thông dụng nhất được trình diễn ở bảng 6.4 .
Bảng 6.4. Các enzyme được sản xuất bởi Aspergillus niger Lipase
Pectin esterase
Amyloglucosidase
Cellulase
Pentosanase
Catalase
Protease
α-galactosidase
α-amylase
Inulinase
Phospholipase
β-glucanase
Phytase
Galactomannase
Glucose oxidase
Arabinase
Pectinase

Tương tự, enzyme cũng hoàn toàn có thể được sản xuất từ những loài vi sinh vật khác, ví dụ có bảy nguồn vi sinh vật khác nhau cho sản xuất glucose isomerase và tám cho α-amylase ( Bảng 6.5 ) .
Bảng 6.5. Các nguồn phổ cập của α-amylase và glucose isomerase α-amylase
Glucose isomerase
Các loại ngũ cốc tạo malt
Actinoplanes missouriensis
Tuyến tụy của động vật hoang dã
Bacillus coagulans
Aspergillus oryzae
Mycobacterium arborescens
Aspergillus niger
Streptomyces murins
Bacillus amyloliquefaciens
Streptomyces olivaceous
Bacilus licheniformis
Streptomyces olivochromogens
Bacillus stearothermophilus
Streptomyces phoenics

Bacillus subtilis

Endomyces spp .
Rhizopus oyzae

Tương tự, enzyme cũng hoàn toàn có thể được sản xuất từ những loài vi sinh vật khác, ví dụ có bảy nguồn vi sinh vật khác nhau cho sản xuất glucose isomerase và tám cho α-amylase ( Bảng 6.5 ) .
Bảng 6.5. Các nguồn thông dụng của α-amylase và glucose isomerase α-amylase
Glucose isomerase
Các loại ngũ cốc tạo malt
Actinoplanes missouriensis
Tuyến tụy của động vật hoang dã
Bacillus coagulans
Aspergillus oryzae
Mycobacterium arborescens
Aspergillus niger
Streptomyces murins
Bacillus amyloliquefaciens
Streptomyces olivaceous
Bacilus licheniformis
Streptomyces olivochromogens
Bacillus stearothermophilus
Streptomyces phoenics
Bacillus subtilis
Endomyces spp .
Rhizopus oyzae

4. Sản xuất enzyme trên quy mô lớn
Nuôi cấy những vi sinh vật trên quy mô lớn là giải pháp kinh tế tài chính nhất do có những ưu điểm sau :
– Sử dụng những môi trường tự nhiên đơn thuần, rẻ tiền .
– Các chu kỳ luân hồi lên men ngắn ngày .
– Có thể trấn áp trạng thái sinh lý của vi sinh vật trong quy trình lên men và bảo vệ được tính giống hệt của những mẻ lên men .
– Có thể kế hoạch hóa việc thu hoạch enzyme một cách hài hòa và hợp lý tương thích với những quy trình phân tách và tinh sạch đầu ra ( downstream processing ) .
– Hiệu suất enzyme hoàn toàn có thể được tăng lên nhiều lần bằng cách cải tổ những chủng truyền thống lịch sử và tăng trưởng quy trình lên men, và với việc sử dụng thêm công nghệ di truyền, trong một khoảng chừng thời hạn tương đối ngắn hoàn toàn có thể cải tổ hiệu suất enzyme lên nhiều lần .
– Các kỹ thuật DNA tái tổng hợp cũng mở ra những thời cơ cho việc sản xuất sinh khối enzyme từ việc nuôi cấy những loài vi sinh vật yên cầu điều kiện kèm theo sinh trưởng khắc khe như : môi trường tự nhiên dinh dưỡng đắt tiền hoặc phải bổ trợ những tác nhân cảm ứng ( inducers ) …
– Các enzyme của những dạng vi sinh vật sống ở điều kiện kèm theo khắc nghiệt ( sinh trưởng ở những điều kiện kèm theo cực đoan của nhiệt độ, muối, áp lực đè nén thẩm thấu, kiềm ) nhờ kỹ thuật DNA tái tổng hợp nay hoàn toàn có thể sinh trưởng thuận tiện trong những nuôi cấy mesophilic ( ưa nhiệt trung bình 20-40 oC ), và hoàn toàn có thể sản xuất những enzyme với những đặc thù chịu nhiệt hoặc chịu muối ở nồng độ cao .
4.1. Lên men E. coli tái tổng hợp
Các enzyme có nguồn gốc từ những sinh vật prokaryote hoàn toàn có thể được sản xuất thuận tiện trên quy mô lớn với hiệu suất cao trong những vật chủ E. coli tái tổng hợp. Các quy trình lên men này hoàn toàn có thể được thực thi ở quy mô từ 3.000 – 6.000 L, và không yên cầu những bước cấy gây ( inoculum cuture ) phức tạp. Một cấu trúc vật chủ thích hợp cho quy trình lên men đặc trưng hoàn toàn có thể như sau :
Vật chủ E. coli mang ( 1 ) vector plasmid có gen mã hóa cho enzyme thiết yếu, ( 2 ) cùng với gen thông tư kháng kháng sinh thích hợp như ampicillin hoặc neomycin, và ( 3 ) một tác nhân cảm ứng như thể TAC ( bộ ba đặc trưng cảm ứng lactose hoặc isopropylthiogalactose ) .
Hiệu quả sản xuất cao như mong ước hoàn toàn có thể đạt được bằng cách lên men mẻ có cung ứng dinh dưỡng ( fed-batch ), trong đó môi trường tự nhiên nuôi cấy mẻ chứa những thành phần cho sự sinh trưởng bắt đầu của vi trùng, ví dụ : glucose 2 %, dịch chiết nấm men ( yeast extract ) 1 %, phosphate 1 % và những loại muối khác cùng với kháng sinh được chọn. Sau khi sự sinh trưởng bắt đầu được thiết lập, những chất dinh dưỡng bổ trợ được cung ứng ở những tỷ suất thích hợp bảo vệ đủ nguồn carbon và nitrogen .
Nguồn carbon thuận tiện là glucose, và nitrogen hoàn toàn có thể là một phức tạp tự nhiên ( ví dụ điển hình như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein ), sirô ngô, một loại muối ammonium đơn hoặc urea .
Nuôi cấy E. coli trong thiên nhiên và môi trường có bổ trợ những hỗn hợp amino acid cho năng lực sinh trưởng và sản xuất enzyme nhanh hơn, tuy nhiên việc sử dụng những nguồn dinh dưỡng đơn thuần hơn ( ví dụ điển hình nguồn nitrogen ), mặc dầu hoàn toàn có thể yên cầu thời hạn lên men lâu hơn, vẫn hoàn toàn có thể tạo ra sự sinh trưởng của tế bào và hiệu suất enzyme cao tương tự như .
Sản xuất enzyme được cảm ứng thuận tiện bằng cách bổ trợ isopropylthiogalactoside từ 30-300 mg / L, hoặc lactose từ 1-10 g / L. Việc quyết định hành động thời hạn và tần số bổ trợ chất cảm ứng là rất quan trọng để thu được hiệu suất enzyme cực lớn .
Mật độ tối ưu trên 200 của OD600 nm ( 50 g khối lượng khô của tế bào / L ) và sự bộc lộ enzyme khoảng chừng 10 g / L ( 30 % của protein tổng số ) là một hiệu quả lên men mong ước. Quá trình lên men thường thực thi trong hai ngày ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của khung hình, nghĩa là từ 24-28 oC .
4.2. Lên men nấm
Các loài nấm vật chủ như Aspergillus và Fusarium, và nấm men hướng methyl5 ( Pichia ) thích hợp cho sản xuất những enzyme glycosyl hóa từ những nguồn động vật hoang dã hoặc nấm. DNA của enzyme được hợp nhất trực tiếp trong DNA nhiễm sắc thể cùng với mạng lưới hệ thống promoter .
Các vật chủ tái tổng hợp hoàn toàn có thể được lên men trong một kiểu tựa như với những nuôi cấy không tái tổng hợp và lên men tỷ lệ cao của tế bào hoàn toàn có thể thuận tiện thu được bằng cách dùng những phương pháp của kỹ thuật sinh học truyền thống lịch sử .
5 Chỉ sử dụng chất dẫn xuất methane như là nguồn carbon và nguồn năng lượng chuyển hóa. Các vật chủ Aspergillus hoặc Fusarium hoàn toàn có thể được sinh trưởng trên những nguyên vật liệu thô rẻ tiền như bột đậu tương có bổ trợ thêm chất dinh dưỡng là sirô ngô ( corn sirup ). Nấm men, như Saccharomyces và Pichia, hoàn toàn có thể sinh trưởng trên dịch chiết nấm men hoặc những dịch thủy phân protein và sirô ngô .
Quá trình nuôi cấy hoàn toàn có thể cho sinh khối tế bào cao bằng cách sử dụng những môi trường tự nhiên đã được xác lập khá đầy đủ có bổ trợ xen kẽ thêm một vài chất dinh dưỡng khác. Lên men đặc trưng lê dài từ 4-8 ngày. Sự biểu lộ enzyme vượt quá 10 g / L đã thu được ở quy mô công nghiệp .
4.3. Các enzyme vi sinh vật sửa chữa thay thế những enzyme động-thực vật
Một số enzyme công nghiệp vẫn được chiết từ những nguồn động vật hoang dã như bò tiềm ẩn nguy hại của sự nhiễm bẩn bệnh não dạng xốp của bò ( bovine spongiorm encephalopathy ). Chẳng hạn renin, sau khi thu từ dạ dày của bê con mới sinh sẽ được sử dụng để làm phomát. Nó vẫn không được bảo vệ liệu có hiện hữu bất kể rủi ro đáng tiếc nào cho sức khoẻ của người tiêu dùng hay không, tuy nhiên, renin tái tổng hợp của bê con lúc bấy giờ hoàn toàn có thể được sản xuất nhờ lên men vi sinh vật là trọn vẹn bảo đảm an toàn .
Một cách khác, bằng phương pháp tách chiết enzyme truyền thống cuội nguồn từ những nguồn vi sinh vật và việc sử dụng kỹ thuật sàng lọc thích hợp, nhiều enzyme mới giống như enzyme thực vật và động vật hoang dã lúc bấy giờ đã được sản xuất. Ví dụ :
– Enzyme protease của Mucor trong nhiều trường hợp đã sửa chữa thay thế renin từ dạ dày của bê .
– Protease của Aspergillus và Bacillus đã sửa chữa thay thế những enzyme dùng trong thuộc da .
– Rất nhiều loại amylase vi sinh vật được tăng trưởng để thay thế sửa chữa hoặc bổ trợ cho những amylase thực vật trong tạo malt của lúa mạch hoặc lúa mì .
– Hơn nữa, 1 số ít enzyme có nguồn gốc động vật hoang dã ( như hoạt tố plasminogen của mô ) cũng được sản xuất trong những vi sinh vật chủ tái tổng hợp và hoàn toàn có thể cung ứng chuỗi protein được tái cuộn xoắn. Các enzyme glycosyl hóa của động vật hoang dã có vú hoàn toàn có thể được biểu lộ trong những khung hình eukaryote như Saccharomyces và Aspergillus. Ở đây, vật chủ sẽ glycosyl hóa enzyme để phân phối hoạt tính vừa đủ mặc dầu những đường glycosyl hóa ở đây hoàn toàn có thể khác ở động vật hoang dã có vú .
Các enzyme hoàn toàn có thể được sản xuất trực tiếp bằng nuôi cấy tế bào động vật hoang dã có vú, tuy nhiên giá tiền sẽ rất cao khoảng chừng từ 1.000 – 5.000 USD / gram, một mức giá chỉ hoàn toàn có thể đồng ý cho việc sản xuất những enzyme trị liệu đặc biệt quan trọng như hoạt tố plasminogen của mô hoặc những protein tương quan .
5. Các nguyên tắc hóa sinh cơ bản
Hiệu suất lên men enzyme vi sinh vật hoàn toàn có thể được cải tổ bằng những kỹ thuật tầm cỡ, tương tự như những kỹ thuật dùng để cải tổ hiệu suất trong lên men kháng sinh. Cả hai sự cải tổ di truyền và quy trình lên men đã dẫn đến sự tăng trưởng của năng lực lên men trong sản xuất protein enzyme lên tới 20 kg / m3. Sự hiểu biết về điều hòa di truyền của quy trình tổng hợp protein là rất quan trọng trong tinh lọc những chủng được cải tổ và tối ưu những quy trình lên men. Có nhiều tác nhân quan trọng hoàn toàn có thể tác động ảnh hưởng đến sản xuất enzyme như sau :
5.1. Sự cảm ứng
Sự tổng hợp enzyme thường bị ức chế ( điều kiện kèm theo để giúp bảo tồn nguồn năng lượng từ sự tổng hợp protein không thiết yếu ) tức là enzyme sẽ chỉ được sản xuất trong sự hiện hữu của một chất cảm ứng, thường là cơ chất của nó. Mức độ cảm ứng ( induction level ) hoàn toàn có thể là rất mạnh ( tăng lên hơn 1.000 lần so với không cảm ứng ) và hoạt động giải trí bằng cách gây cản trở sự điều hòa tác nhân ức chế. Nhiều enzyme dị hóa hoàn toàn có thể được cảm ứng, như :
– Sucrose thiết yếu cho sản xuất invertase6 .
– Tinh bột cho sản xuất amylase7 .
6 Invertase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân những disaccharide thành những monosaccharide, đặc biệt quan trọng thủy phân saccharose thành dextrose và levulose .
7 Amylase là enzyme xúc tác thủy phân những loại carbohydrate dự trữ như tinh bột trong thức ăn thực vật hay glycogen trong thức ăn động vật hoang dã .
– Galactoside cho sản xuất β-galactosidase .
Trong 1 số ít trường hợp, một mẫu sản phẩm hoặc một mẫu sản phẩm trung gian cũng hoàn toàn có thể hoạt động giải trí như một chất cảm ứng, ví dụ :
– Phenylacetate cảm ứng penicillin G amidase .
– Các acid béo cảm ứng lipase .
– Xylobiose cảm ứng những xylanase .
Sự cảm ứng mẫu sản phẩm thường xảy ra trong quy trình tổng hợp những enzyme ngoại bào thiết yếu cho việc thủy phân những polymer có khối lượng phân tử lớn để chúng hoàn toàn có thể đi vào tế bào và liên tục gây ra sự cảm ứng .
Các coenzyme8 cũng hoàn toàn có thể hoạt động giải trí như những chất cảm ứng, ví dụ : thiamine cảm ứng pyruvate decarboxylase. Hơn nữa, để có hiệu suất cao trong sản xuất enzyme, sự cảm ứng là điều kiện kèm theo thiết yếu để quyết định hành động hài hòa và hợp lý thời hạn sản xuất enzyme trong hệ lên men bảo vệ thu được lượng mẫu sản phẩm cao nhất .
Tuy nhiên, trong trong thực tiễn sự cảm ứng thường được thực thi bằng hỗn hợp những tác nhân cảm ứng đắt tiền, được khử trùng và bổ trợ ở những thời hạn đặc biệt quan trọng để thiết lập sự lên men. Để khắc phục những yếu tố này những đột biến điều hòa hoàn toàn có thể được sản xuất để không phụ thuộc vào tác nhân cảm ứng và thế cho nên được gọi là những đột biến cấu thành .
5.2. Ức chế ngược
– Ức chế ngược ( feedback repression ) là tính năng ức chế bằng cách cố định và thắt chặt tác động ảnh hưởng dị lập thể của một chất lên hoạt tính của tối thiểu một trong những enzyme xúc tác những bước chuyển hóa dẫn đến sinh tổng hợp riêng của chất đó .
– Tổng hợp enzyme cũng được kiểm soát và điều chỉnh bởi sự ức chế ngược Open ở những enzyme thiết yếu cho quy trình sinh tổng hợp những chất có phân tử lượng thấp ( ví dụ điển hình là một loại amino acid ), trong đó sự tích lũy của loại sản phẩm sau cuối hoàn toàn có thể gây ức chế sự tổng hợp
8 Một chất hữu cơ thường là một vitamin hay một chất tổng hợp từ vitamin để công dụng lên một cofactor ( một chất phi protein như : Cu, Fe hoặc Zn hay một phân tử hữu cơ ) giúp enzyme xúc tác một phản ứng trao đổi chất .
Các enzyme đặc biệt quan trọng, thường thì là enzyme tiên phong trong con đường sinh tổng hợp. – Người ta nhận thấy mẫu sản phẩm ở đầu cuối của quy trình sinh tổng hợp một chất có năng lực gây ra sự ức chế quy trình tổng hợp của chính nó. Sản phẩm ở đầu cuối dù được tế bào tổng hợp hay thu nhận từ môi trường tự nhiên bên ngoài, khi ở nồng độ dư thừa so với nhu yếu của khung hình vi sinh vật sẽ ảnh hưởng tác động đến enzyme tiên phong trong con đường sinh tổng hợp .
Enzyme tiên phong ( a ) là một enzyme dị lập thể. Nó có đặc thù đổi khác thông số kỹ thuật khoảng trống khi xuất hiện mẫu sản phẩm ở đầu cuối nhằm mục đích giảm bớt hoạt tính xúc tác của mình. Ở enzyme này, ngoài vị trí gắn với cơ chất A ( TT xúc tác ), nó còn có một hay nhiều vị trí gắn với mẫu sản phẩm sau cuối X gọi là TT dị lập thể. Trung tâm xúc tác và TT dị lập thể tách biệt nhau về khoảng trống và khác nhau về cấu trúc. Trạng thái hoạt động giải trí của enzyme này được đặc trưng ở chỗ nó có năng lực gắn với cơ chất A và nếu bên cạnh cơ chất A còn có sự hiện hữu của X ở mức độ dư thừa so với nhu yếu của khung hình vi sinh vật, thì sẽ xảy ra sự vây hãm của TT dị lập thể, làm cho TT xúc tác bị đổi khác thông số kỹ thuật khoảng trống đến mức khiến cho enzyme ( a ) không hề gắn được với cơ chất A mà chỉ gắn với X. Như vậy enzym ( a ) sẽ không có hiệu lực hiện hành trong việc chuyển hoá A thành B. Chuỗi tổng hợp X sẽ bị gián đoạn do đó X sẽ bị giảm số lượng. Ví dụ minh họa ức chế ngược so với tryptophan
Các đột biến ức chế ngược hoàn toàn có thể thu được bằng cách tinh lọc những nuôi cấy kháng những độc tố của chất đồng đẳng của loại sản phẩm. Các dòng tế bào sống sót sẽ mất sự mẫn cảm ngược so với mẫu sản phẩm. Các đột biến tương tự như hoàn toàn có thể thu được bằng cách phân lập những đột biến khuyết dưỡng ( nutritional auxotrophs ), những đột biến này không hề tạo ra loại sản phẩm sau cuối, mà nhờ vào vào sự bổ trợ hợp chất này từ môi trường tự nhiên bên ngoài để sinh trưởng thông thường. Sự phân phối chất dinh dưỡng được kiểm soát và điều chỉnh này sẽ hạn chế những nồng độ trong nội bào tới mức để sự ức chế ngược xảy ra ít hơn .
5.3. Ức chế dinh dưỡng
Tổng hợp enzyme cũng hoàn toàn có thể được được kiểm soát và điều chỉnh bằng sự ức chế dinh dưỡng đặc trưng bởi carbon, nitrogen, phosphate hoặc sulphate. Những chính sách này sống sót để duy trì sự sản xuất của những enzyme không thiết yếu .
Dẫn chứng tốt nhất là sự kiểm soát và điều chỉnh nhờ hiện hữu của glucose mà trong đó carbohydrate này hoàn toàn có thể làm ngừng sản xuất của những enzyme thiết yếu cho sự chuyển hóa của những hợp chất tương quan và không tương quan ( hiệu ứng glucose ). Ức chế glucose là một khái niệm chính trong nuôi cấy sinh khối tế bào ở quy mô lớn ( nguyên vật liệu thô có giá trị kinh tế tài chính nhất của quy trình lên men ). Sự ức chế dị hóa glucose hoàn toàn có thể là rất mạnh và thường ngưng trệ hiệu suất cao của chất cảm ứng. Các nguồn carbon khác như lactate, pyruvate, succinate và citrate, cũng là những chất ức chế hiệu suất cao trong một số ít vi sinh vật. Thậm chí citrate cũng hoàn toàn có thể ức chế sự chuyển hóa của glucose ở một số ít vi trùng .
Sự ức chế dị hóa glucose cũng được xử lý về mặt di truyền bằng cách tinh lọc những thể đột biến chống lại hiện tượng kỳ lạ này. Các đột biến hoàn toàn có thể tinh lọc thuận tiện từ thiên nhiên và môi trường nuôi cấy chứa glucose và cơ chất của enzyme thiết yếu, ví dụ : hỗn hợp glucose / aspartate được cho phép tinh lọc những dòng sản xuất aspartate không bị ức chế glucose ( aspartate được phân phối ở đây chỉ là nguồn nitrogen ). Sản xuất penicillin G amidase trong E. coli được tăng lên nhiều lần bằng cách tinh lọc những đột biến có năng lực sinh trưởng trên amide như thể một nguồn nitrogen duy nhất trong sự hiện hữu của glucose. Kết quả tạo ra những dòng vi trùng có năng lực sản xuất mạnh và không dễ bị ức chế bởi glucose. Sử dụng dạng đồng đẳng của glucose, 2 – deoxyglucosse, cũng là một phương pháp hiệu suất cao để tinh lọc những đột biến không có ức chế glucose .
+ 4NH là một nguồn nitrogen rất có giá trị. Các muối ammonium là nguồn nitrogen rất rẻ so với những hỗn hợp amino acid, nhưng sự hiện hữu của những amino acid thường được cho phép vi sinh vật sinh trưởng mạnh và nhanh. Một số đột biến không bị ức chế bởi nguồn nitrogen cũng hoàn toàn có thể được tinh lọc dựa trên cơ sở đặc thù chống chuyển hóa ammonium ( sự methyl hóa ammonium-methylammonium ) .
6. Bất động enzyme
Bất động enzyme ( enzyme immobilization ) s_ là link giữa một enzyme với một chất mang rắn, đặc trưng là những hạt polymer trong cột hoặc trong lớp nền ( bed ). Các nguyên vật liệu bất động đặc trưng hoàn toàn có thể là silica hoặc carbohydrate polymer như Sephadex. Bất động enzyme có hai ưu điểm chung :
– Cho phép tịch thu enzyme nhanh và thuận tiện từ hỗn hợp phản ứng, bằng cách tách rời ra khỏi hạt. Điều này thích hợp cho cả hai quy trình tinh sạch hỗn hợp phản ứng và tịch thu enzyme có giá trị .
– Biến đổi những đặc thù hóa học của enzyme. Nhiều enzyme không thay đổi hơn khi link với mặt phẳng để cố định và thắt chặt thông số kỹ thuật của chúng trong một dạng hoạt động giải trí, do đó sẽ làm chậm những phản ứng khử hoạt tính enzyme .
Sự bất động là rất thiết yếu trong những quy trình đổi khác sinh học ( biotransformation ) công nghiệp. Chẳng hạn, tổng hợp thuốc chống ung thư Camptosar sử dụng enzyme lipase để phân giải thành một chiral9 trung gian : quy trình này chỉ có hiệu suất cao kinh tế tài chính nếu lipase được bất động, tạo cho nó một sự không thay đổi bổ trợ và hiệu suất cao .
Các enzyme được bất động được sử dụng rất thông dụng trong sản xuất bộ cảm ứng sinh học ( biosensor ) và xét nghiệm sinh học ( bioassay ). Ở đây mục tiêu chính là để giữ chúng cố định và thắt chặt ở một chỗ để không bị rửa trôi .
Hơn 95 % enzyme được bán trong những dạng hòa tan, đa phần trong chúng được sử dụng trực tiếp và riêng lẽ, đặc biệt quan trọng trong công nghiệp bia và công nghiệp thực phẩm. Đối với một số ít ứng dụng nhất định, cần có enzyme ở dạng bất động sao cho hoàn toàn có thể tái sử dụng chúng và thuận tiện vô hiệu khỏi hỗn hợp phản ứng. Việc thuận tiện vô hiệu sự xúc tác của enzyme bảo vệ tịch thu loại sản phẩm tốt hơn và giảm thiểu sự lẫn lộn của protein enzyme còn dư trong loại sản phẩm .
6.1. Các kỹ thuật bất động
9 Chiral : Một vài phân tử có dạng “ tay phải ” và “ tay trái ” riêng không liên quan gì đến nhau, mặc dầu chúng mang những nguyên tử giống nhau và link trong cùng một kiểu nhưng đặc thù vật lý lại khác nhau. Một chất như thế được gọi là hợp chất chiral, và hai ( hoặc nhiều ) dạng hơn thì mỗi dạng được gọi là chất đối hình ( enantiomer ) hoặc chất đồng phân quang học ( optical isomer ) .
Có nhiều kỹ thuật để bất động enzyme. Tuy nhiên, việc lựa chọn đúng mực tùy thuộc vào ứng dụng sau cuối của chất xúc tác :
6.1.1. Gắn enzyme lên chất mang bằng giải pháp hấp phụ vật lý và link ion .
Nguyên tắc : Hấp phụ enzyme lên những chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein enzyme như lực Van der Waalls, link hydro và link kỵ nước. Khi chất mang không có lỗ xốp, enzyme sẽ bám trên mặt phẳng chất mang. Khi chất mang có lỗ xốp thì enzyme chui vào trong những lỗ xốp của chất mang .
6.1.2. Gắn enzyme bằng link đồng điệu trị
Thường có hai chiêu thức :
– Phương pháp 1 : Gắn enzyme lên chất mang bằng link đồng hóa trị. Có hai cách : ( 1 ) Gắn một quá trình, quy trình tích hợp enzyme hoàn toàn có thể xảy ra qua một tiến trình nếu chất mang có chứa những nhóm có năng lực tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme. ( 2 ) Gắn hai quá trình, quy trình tiến độ đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào những nhóm có năng lực phản ứng hơn, quy trình tiến độ hai là tiến trình tích hợp enzyme .
– Phương pháp 2 : Gắn enzyme với nhau bằng link đồng hóa trị. Nguyên tắc của chiêu thức này là liên két chéo đồng hóa trị những phân tử enzyme lại với nhau, tạo thành cấu trúc đại phân tử không tan nhờ những tác nhân lưỡng hoặc da chức mà không càn đến những chất mang .
6.1.3. Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel
Nguyên tắc : Phân tử enzyme được giữ trong mạng lưới khoảng trống của một polymer không tan trong nước. Gel hoàn toàn có thể được điều chế từ những polyacrylamide, hydroxyethyl-2-metacrylate tạo mạng lưới bằng ethyleneglycol-dimetacrylate, polyuretan, polyvinyl .
Gói enzyme vào trong khuôn gel có bốn giải pháp :
– Phương pháp 1 : Enzyme được gói vào trong khuôn gel ( ví dụ : alginate ) dưới dạng hạt. Enzyme được hòa tan trong dung dịch monomer sau đó monomer này được polymer hóa với sự xuất hiện của một hay nhiều tác nhân tạo mạng lưới ( reticulation ). Chẳng hạn, Có thể nhỏ giọt dung dịch enzyme + sodium alginate vào dung dịch giàu CaCl2 lúc đó enzyme sẽ được gói trong những hạt calcium alginate .
– Phương pháp 2 : Enzyme bị nhốt trong những lố nhỏ của những sợi tổng hợp. Có thể nhốt enzyme vào trong những lỗ nhỏ của sợi tổng hợp bằng cách cho những dòng chất lỏng chảy tuần hoàn bên trong sợi. Hoặc hoàn toàn có thể nhốt enzyme trong những mạng lưới collagen. Hoặc dùng enzyme trong dung dịch đệm chứa glycerol và dung dịch nhũ tương của triacetate cellulose trong methylene chloride được đùn ép qua một khuôn có lỗ dưới áp suất nitrogen. Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào bể đông tụ có chứa toluene, sau đó sấy khô sợi trong chân không .
– Phương pháp 3 : Gói enzyme trong bao vi thể ( microcapsule ). Nhốt enzyme trong một bao vi thể số lượng giới hạn bởi một màng bán thấm. Màng này có kích cỡ lỗ xốp đủ nhỏ để ngăn chận sự khuếch tán enzyme ra ngoài nhưng đủ lớn để cho cơ chất và mẫu sản phẩm đi qua trong quy trình phản ứng .
– Phương pháp 4 : Tạo link chéo giữa những tiền polymer bằng chiếu quang để gói enzyme. Các chất tiền polymer thường dùng là : ENT ( metacrylate ), PEGM ( polyethylene-glycoldimetacrylate ), ENTP ( tổng hợp từ hydroxyethylacrylate ), trong đó PEGM và ENT hòa tan trong nước, còn ENTP không tan trong nước. Khi chiếu tia cực tím gần ( 360 nm ) lên dung dịch có chứa chất tiền polymer + enzyme + chất nhạy quang ( benzoin ethylete, benzoin isobutylete ) sẽ tạo ra link chéo giữa những gốc của tiền polymer. Từ đó gel được hình thành và bao lấy enzyme .
6.1.4. Cố định enzyme trên tế bào vi sinh vật
Một giải pháp mới có rất nhiều tiềm năng là sử dụng mặt phẳng vi sinh vật để gắn những chất có hoạt ính sinh học : protein tính năng, enzyme, thụ thể, kháng nguyên, kháng thể và ứng dụng vào nhiều nghành nghề dịch vụ công nghệ khác nhau như : nhận dạng phân tử, cố định và thắt chặt enzyme, chữa bẹnh sinh học, đổi khác sinh học, gắn tế bào vào tế bào, sản xuất vaccine. Trong đó, việc điều tra và nghiên cứu gắn enzyme trên bè mặt tế bào vi sinh vật là một giải pháp mới cũng rất được chăm sóc. Chẳng hạn người ta đã cố định và thắt chặt amylase, glucoamylase, cellulase trên mặt phẳng tế bào nấm men, chuyển hóa tinh bột và cellulose thành đường glucose một cách thuận tiện. Hoặc cố định và thắt chặt lipase để giúp chuyển hóa dầu thực vật và mỡ tạo nguồn năng lượng …
6.2. Các chất mang cho sự bất động
6.2.1. Bất động enzyme bằng hấp phụ hay link ion thường dùng những loại chất mang sau :
– Chất mang hữu cơ : than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin
– Chất mang vô cơ : Silic, thủy tinh xốp, oxide sắt kẽm kim loại .
– Chất trao đổi ion : Ambelit, DEAE10-sephadex, CM11-sephadex, DEAE-cellulose, CM-cellulose .
– Polymer tổng hợp : polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nylon, polyvinyl .
6.2.2. Gắn enzyme lên chất mang bằng link đồng hóa trị thường dùng những chất mang sau :
– Polymer hữu cơ như : polypeptide, polysaccharide : dextran ( sephadex ), agarose ( sepharose ) .
– Các dẫn xuất của cellulose : CM-celllulose, DEAE-cellulose, DEAE-sephadex, CM-sephadex .
– Các polymer tổng hợp : polyamide, polyacrylamide, polystyrol, polyvinyl .
– Các chất vô cơ : silicagel, bentonite, aluminium hydroxide .
6.2.3. Gắn enzyme với nhau bằng link đồng hóa trị thường dùng tác nhân kết nối là glutaraldehyde

Theo nhập môn công nghệ sinh học của

Nguyễn Hoàng Lộc

Source: https://dvn.com.vn
Category: Công Nghệ